Nel fervido clima culturale della Firenze del primo dopoguerra, i fratelli Rosselli si legano a Gateano Salvemini, sotto la cui supervisione Nello si dedica alla ricerca storica laurendosi in Filosofia e Filologia nel 1923 con una tesi sugli ultimi anni della vita di Mazzini; parallelamente Carlo, colpito dalla scoperta dell'Italia proletaria nelle trincee della Grande Guerra, si laurea in Scienze politiche nel 1921 per poi perfezionare la propria formazione con la laurea in Legge conseguita a Siena nel 1923. L'anno successivo è assistente di Luigi Einaudi nel corso di Economia politica alla Bocconi di Milano. è lo stesso periodo in cui a Firenze imperversano le squadracce fasciste, i cui scontri con gli ardimentosi esponenti dell'antifascismo locale spingono i fratelli Rosselli a passare all'azione. Nel giugno del 1924 danno vita all'associazione clandestina "Italia Libera", cui aderirono personaggi che in seguito rivestirono un ruolo di primo piano nella Resistenza quali Nello Traquandi e Nello Niccoli, oltre ai quali va ricordato anche Ernesto Rossi; nel gennaio 1925 viene dato alle stampe il primo numero di "Non mollare", il primo foglio di stampa clandestina del movimento antifascista italiano. Frattanto, Carlo aderisce al Partito Socialista Unitario.
Nel dicembre 1926 Carlo organizza, insieme a Ferruccio Parri, Sandro Pertini, Riccardo Bauer e Umberto Ceva, l’espatrio di Filippo Turati; di conseguenza viene condannato a dieci mesi di carcere, e nel settembre 1927 a cinque anni di confino nell’isola di Lipari, dove viene trasferito in dicembre. Nel luglio 1929 fugge da Lipari in motoscafo insieme a Emilio Lussu e Francesco Fausto Nitti, e giunge a Parigi, dove fonda il periodico "Giustizia e libertà". Nello, arrestato in quanto aderente all'Unione Nazionale di Giovanni Amendola, è tratto in arresto e rilasciato più volte: raggiunge più volte il fratello nell'esilio parigino, ed è al suo fianco durante la Guerra di Spagna, ove i due si distinguono al comando di diverse formazioni repubblicane. Celebre la frase «Oggi qui, domani in Italia», pronunciata da Carlo durante un discorso pronunciato ai microfoni di Radio Barcellona il 13 novembre 1936 in cui s'invitavano i volontari italiani ad accorrere in soccorso del legittimo governo repubblicano.
Il 9 giugno 1937, mentre i due fratelli si trovano nella località termale di Bagnoles-de-l'Orne, in Normandia, ove Carlo sta curando i postumi di una grave flebite, vengono raggiunti dai sicari della Cagoule, un'organizzazione fascista francese che agisce dietro incarico del regime fascista italiano, e assassinati a pugnalate su un'isolata strada di campagna.
Sulla loro tomba nel cimitero di Trespiano, vicino Firenze, ove le loro spoglie riposano nel sacrario di Giustizia e Libertà assieme a quelle di Enrico Bocci, Nello Traquandi, Ernesto Rossi e Gaetano Salvemini, Pietro Calamandrei fece incidere l'epitaffio:
𝐺𝑖𝑢𝑠𝑡𝑖𝑧𝑖𝑎 𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎̀: 𝑝𝑒𝑟 𝑞𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝑚𝑜𝑟𝑖𝑟𝑜𝑛𝑜, 𝑝𝑒𝑟 𝑞𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝑣𝑖𝑣𝑜𝑛𝑜
